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論文解讀--異甘草甙通過招募巨噬細胞促進血管生成從而促進斑馬魚傷口愈合

出處:水生動物健康評估公眾號 作者:小破同學 水產養殖網 2020-04-06 21:38:00

甘草在南歐和亞洲部分地區廣泛應用于治療各種疾病。異甘草甙是甘草的水溶性異黃酮成分,據報道異甘草甙對斑馬魚胚胎受損的血管系統有額外的促血管生成作用,因此可能有治療血管生成不足引起的病理疾病的潛力并推測異甘草甙可能具有促進皮膚傷口愈合的活性。今天給大家分享一篇文章——《Isoliquiritin promote angiogenesis by recruiting macrophages to improve the healing of zebrafish wounds》,以斑馬魚為創面愈合模型動物,探索并證實了異甘草甙在皮膚創面愈合中的藥理活性,并通過轉基因斑馬魚胚胎來闡明其潛在機制,引用信息如下:
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一、異甘草甙可以促進成年斑馬魚傷口愈合

為了確定傷口愈合率,將6個月大的野生型斑馬魚分為3組,每組10只。所有魚麻醉后,在左側肛門和背鰭間使用一次性無菌活檢穿孔機打出一個直徑2毫米的全層傷口。實驗組分別使用100μg /毫升和200μg /毫升的異甘草甙溶液每天浸泡20分鐘,處理7天。對照組使用0.1% DMSO處理。隨后分別在1、3、5、7、10、12、15 dpw進行傷口檢查。
結果發現所有組傷口在第三天達到最大創口面積后逐漸開始愈合(圖1.B),且200μg/毫升的異甘草甙治療組的傷口在第5/10/15天明顯變小,愈合速度更快(圖1.A)。
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圖1. 斑馬魚傷口愈合分析

二、異甘草甙處理后斑馬魚創面愈合的組織學分析
選用創傷后第六天的斑馬魚進行創面愈合的組織學分析。H & E組織切片結果顯示:異甘草甙處理后的斑馬魚創面完全充滿了厚的上皮細胞層,真皮致密,而未處理的損傷組織傷口邊緣只有一層薄的上皮細胞層(新上皮)。而且異甘草甙處理后的斑馬魚創面肉芽組織面積也明顯小于對照組,說明肉芽組織迅速退化,加速了創面愈合的過程。此外,異甘草甙處理組的斑馬魚傷口肌肉組織更為致密,而對照組肌肉組織間隙較大,仍處于疏松分解狀態。
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圖2. H&E組織切片(含皮膚和肌肉)
 (A和C)對照組未處理,(B和D)為實驗組:A、B: 200×;C和D: 400×。傷口面積用虛線標出。Ep:上皮細胞,gt:肉芽組織。小黑箭頭:薄上皮,免疫細胞浸潤;粗黑箭頭:上皮層形成;黃色箭頭:真皮層;紅色箭頭:真皮層分解的肌細胞;白色箭頭:密集排列的肌肉細胞。

三、異甘草甙能夠促進血管生成
為觀察創面血管生成,受精后4天的斑馬魚(內皮細胞中表達增強的綠色熒光蛋白EGFP)胚胎分為3組,每組35個。斑馬魚麻醉后用針刺入與泄殖腔相對的背體進行創面誘導。隨后,胚胎立即轉移到新鮮的胚胎水中恢復。2小時以后,將斑馬魚分別用100μg /毫升和200μg /毫升的異甘草甙溶液進浸泡,對照組用0.1% DMSO處理。實驗結果發現與損傷2小時后的斑馬魚胚胎血管長度相比,異甘草甙處理組在24 小時以后血管新生長度明顯長于對照組(圖3.A)。定量分析24例hpw的虛線框內血管生成率(圖3.B)。兩組的血管生成率均顯著高于對照組(P < 0.001),且呈濃度依賴性增高。這一結果表明異甘草甙可以促進創面愈合。
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圖3. 異甘草甙能夠促進血管生成

四、異甘草甙的促炎作用
為了闡明異甘草甙促進傷口血管生成與巨噬細胞之間的關系,使用了雙轉基因斑馬魚胚胎(內皮細胞-綠色熒光蛋白,巨噬細胞-紅色熒光蛋白)進行實驗。如圖4所示,各組創面形成后,巨噬細胞均在一定時間內被招募到創面區域。對照組,巨噬細胞從2小時到24小時逐漸招募聚集(圖4.A)。而異甘草甙處理組在每個時間點可以觀察到有更多的巨噬細胞到達損傷部位。在6小時,兩種濃度的異甘草甙處理組損傷部位的巨噬細胞都顯著增加。
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圖4. 異甘草甙能夠促進血管生成

五、基因定量分析
在24小時,損傷組所有基因表達均高于非損傷組,尤其是sod1、tgf-β,tnf-α的表達,這可能表明斑馬魚胚胎往往有一個活躍的自愈能力。血管生成相關基因vegfa和 flk-1在200μg /毫升的異甘草甙溶液治療組高表達,ang-2在兩種異甘草甙處理組中的表達均呈劑量依賴性上調。炎癥相關基因tgf-β, il-1β, tnf-α, mmp-9, mmp-13以及抗氧化基因sod1在200μg /毫升的異甘草甙溶液治療組相對于創傷對照組高表達,除了mmp-9之外都呈計量依賴性。因此,推測異甘草甙可以通過上調血管生成相關基因和炎癥基因加速炎癥反應和血管生成,從而促進皮膚創面愈合。
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圖5. 基因定分析

六、結論
綜上所述,研究首次證明了異甘草甙可以促進斑馬魚皮膚傷口的愈合。其機制是促進炎癥反應和促進血管生成。這一發現豐富了甘草的藥用價值。異甘草甙可以作為一種潛在的傷口愈合藥物。
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圖6.甘草及異甘草甙
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